Die Bezeichnung Gensynthese ist eigentlich irreführend. Tatsächlich kann jede DNA-Sequenz de novo synthetisiert und anschließend in einen beliebigen Plasmid Vektor subkloniert werden. Es spielt dabei keine Rolle, ob es sich um ein bekanntes Gen, einen offenen Leserahmen (open reading frame ORF), eine cDNA, einen Promotor oder um ein komplett neu identifiziertes Gen (z.B. über Next Generation Sequencing) handelt.

Jede DNA-Sequenz kann in beliebiger Länge schnell und in zuverlässiger Qualität synthetisiert werden.

Subklonierung

Mühsame Laborarbeiten um Klone für Ihr Experiment zu erhalten sind nicht mehr notwendig. Alle benötigten Konstrukte für jede Applikation können Sie ab sofort ganz einfach bestellen.

Mit der Gensynthese-Technologie kann beinahe jede doppelsträngige DNA von uns synthetisiert und in einen Plasmid Vektor Ihrer Wahl subkloniert werden. Alle synthetisch hergestellten Fragmente werden mittels Doppelstrang-Sequenzierung kontrolliert, um eine 100%ige Sequenzübereinstimmung zu gewährleisten.

cDNA-Klonierung

Die cDNA-Klonierung ist eine sehr arbeitsintensive und kostspielige Methode: Dies beginnt mit der Auswahl des richtigen Ausgangsmaterials, das erst beschafft und dann unter den korrekten Bedingungen aufbewahrt werden muss, wofür meist Stickstoff erforderlich ist. Danach folgen die mRNA-Extraktion unter RNase-freien Bedingungen, die Reverse Transkription und die PCR und Subklonierung.

Durch Analyse der cDNA-Klone mittels DNA-Sequenzierung kann sich möglicherweise herausstellen, dass das 5’- oder 3’-Ende der cDNA fehlt oder dass sich Mutationen eingeschlichen haben. In solchen Fällen müssen dann alternative Methoden wie RACE-PCR oder ortsgerichtete Mutagenese (site directed mutagenesis, SDM) eingesetzt werden, um die vollständigen cDNAs zu erhalten.

Im Gegensatz dazu erhalten Sie die von Ihnen gewünschte vollständige DNA schneller, bequemer und kostengünstiger, wenn Sie diese einfach über unseren Gensynthese-Service bestellen. Sogar Splice-Varianten der Sequenz sind erhältlich.

qPCR und PCR Standards

Dank der Gensynthese ist es heutzutage möglich, einen einzigen Standard für all Ihre qPCR oder PCR Reaktionen zeit- und kosteneffizient herzustellen, anstatt viele Standardsequenzen einzeln bestellen zu müssen. Unter Verwendung der IUB Nomenklatur sind sogar z.B. zwei Alternativen einer SNP Positionen in einer Sequenz möglich.

In Kooperation mit der Firma Biolink haben wir die Software GENEius entwickelt, die nicht nur offene Leserahmen (ORFs) an die Codon Usage jedes heterologen Organismus anpasst, sondern auch die komplette zu synthetisierende Sequenz optimiert. Die GENEius Software vermeidet Repeats und Hairpin Strukturen, kann ungewollte DNA Motive wie Restriktionsschnittstellen oder arifizielle Spleißstellen ausschließen und baut sogar z.B. nützliche Schnittstellen ein.

Anpassung der Codon Usage

Die in jedem Organismus vorhandenen 20 Aminosäuren werden von 64 Tripletts kodiert. Manch Aminosäuren werden von bis zu sechs verschiedenen Codons kodiert. Jede Spezies hat ein anderes Codon Usage-Muster. Das heißt, dass manche von den Codons, die für die selbe Aminosäure kodieren, häufiger genutzt werden als andere. Ein Beispiel ist das Arginin, das von sechs Codons kodiert wird. E.coli verwendet zwei dieser Codons mit einer Häufigkeit von jeweils ca. 40%; die anderen Codons hingegen sehr selten. Wird nun eine kodierende Sequenz eines anderen Organismus in ein E.coli Expressionssystem eingeführt, so werden diese vier in E.coli sehr selten verwendeten Arginin Codons höchstwahrscheinlich zu einer schlechten Proteinexpression führen.

Der zu synthetisierenden ORF kann ganz einfach an die Codon Usage jedes Organismus angepasst werden, um eine optimale Translation der Proteine in heterologen Expressionssystemen zu gewährleisten. Damit werden die Codons mit der optimalen Häufigkeit für den jeweiligen Organismus verwendet und über die Sequenz gleichmäßig verteilt. Sehr seltene Codons können ganz ausgeschlossen werden.

Promoter- und Enhancer-Elemente

Um eine höhere Expression der mRNA und des Proteins zu erhalten, können mit Hilfe der Gensynthese passende Promoter oder Enhancer Elemente ausgewählt und zu der kodierenden Sequenz hinzugefügt werden.

Erwünschte und unerwünschte Schnittstellen

Unerwünschte Restriktionsschnittstellen, artifizielle Spleißstellen oder potenzielle Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren innerhalb Ihrer Sequenz können mithilfe der Gensynthese vermieden werden. Mit GENEius erreichen wir auch eine gleichmäßige Verteilung von Gs und Cs und können sogar einzelne erwünschte Restriktionsschnittstellen (Unique Sites), abhängig von der jeweiligen Aminosäuresequenz, z.B. für später geplante Subklonierungen gezielt einführen.

Konstruktion von Hybridgenen

Mithilfe unseres Gensynthese Services können Proteindomänen neu angeordnet, Introns entfernt oder hinzugefügt, sowie komplett neue Hybridgene durch Kombination vorhandener Genfragmente, kreiert werden. Für eine spätere Reinigung von rekombinanten Proteinen können auch z.B. His-Tags hinzugefügt werden.

Genbibliotheken

Die Herstellung von Genbibliotheken mit einzelnen oder mehrfachen Mutationen, um z.B. nach verbesserten Eigenschaften von Proteinen zu screenen, ist mit unserem Gensynthese Service ebenfalls leicht möglich.